De diagnose wordt meestal in twee stappen gesteld. Eerst doet de arts een algemeen onderzoek. Daarna volgt onderzoek dat speciaal gericht is op het syndroom van Barth.

Bij het algemene onderzoek doet de arts eerst lichamelijk onderzoek. Daarna maakt de arts een echo van het hart, een foto van de borstkas en een hartfilmpje. Ook is er laboratoriumonderzoek van het bloed en de urine. Bij jongens met het syndroom van Barth is er meestal te veel van een bepaald zuur in de urine. Dat heet 3-methylglutaconzuur. Dat is een belangrijk teken voor de ziekte. Maar let op: bij sommige patiënten is dit zuur ook normaal. Dan is de diagnose lastiger.

Met speciaal onderzoek kan de ziekte zeker worden vastgesteld. Daarbij kijkt de arts naar de werking van de mitochondriën. Bij patiënten met het syndroom van Barth werken die niet goed. Dat komt door een tekort aan cardiolipine. Cardiolipine bestaat uit verschillende vormen. De actieve vorm heet tetralineoyl-cardiolipine. Bij patiënten kan een laboratorium zien dat deze vorm te weinig wordt gemaakt. Dit onderzoek gebeurt vaak in gekweekte huidcellen (fibroblasten).

Tot slot kan ook DNA-onderzoek worden gedaan. Daarbij wordt gezocht naar een fout in het gen dat het syndroom van Barth veroorzaakt (TAFAZZIN).