De aanwezigheid van een vergrote lever en milt, eventueel met een "cherry red spot" in de ogen en typische cellen in het beenmerg ("Niemann-Pick foam cellen" genoemd), kunnen een aanwijzing zijn voor de diagnose.
Voor een definitieve diagnose is echter enzymonderzoek nodig. In het laboratorium kunnen bloedcellen of huidcellen worden gebruikt om te bepalen hoeveel activiteit het enzym sphingomyelinase bij de patiënt nog heeft. Bij type B is er meestal nog ongeveer 5 tot 10% restactiviteit, wat de ziekte onderscheidt van de ernstiger type A-variant (waar de restactiviteit vrijwel afwezig is). Bij patiënten met een verwante ziekte (bijv. Niemann-Pick type C of de ziekte van Gaucher) zijn die waarden veel hoger (tot bijna normaal).
Bij meerdere van de sphingolipidosen zijn bepaalde marker enzymen in het bloed sterk verhoogd, zoals het enzym chitotriosidase. Dit kan een snelle screen zijn om te kijken of patiënten een stapelingsziekte hebben, maar het is niet specifiek en daarom blijft het aantonen van een tekort aan specifieke enzymactiviteit de gouden standaard voor het stellen van de diagnose.

Het is mogelijk om het DNA van de patiënt te onderzoeken om erachter te komen welke mutatie de patiënt heeft. Als de mutatie bekend is, is het mogelijk om binnen de familie dragerschapsonderzoek uit te voeren. Ook prenataal onderzoek met het oog op nieuwe zwangerschappen is betrouwbaarder als de DNA-mutatie bekend is. Het is echter ook mogelijk om de enzymactiviteit te bepalen met behulp van een vlokkentest.