De diagnose GLUT1-DS wordt gesteld op basis van het klinisch onderzoek in combinatie met een ruggenprik. Een ruggenprik is nodig om hersenvocht te kunnen onderzoeken. In het hersenvocht wordt een laag glucosegehalte gevonden, terwijl het bloedsuiker wel normaal is. Onderzoek toonde aan dat alle patiënten in principe kunnen worden opgespoord met een ruggenprik. MRI- en CT-scans van de hersenen zijn bij GLUT1-DS overigens normaal.

De diagnose kan worden bevestigd door genetisch onderzoek, waarbij bij het grootste deel van de patiënten een mutatie wordt gevonden in het SLC2A1-gen. Er zijn echter ook patiënten met het GLUT1-deficiëntiesyndroom zonder mutatie in het SLC2A1-gen. Ook de laatstgenoemde groep patiënten heeft baat bij een ketogeen dieet. Dit toont het belang van een ruggenprik in het diagnostisch traject des te meer aan.

Prenataal onderzoek is mogelijk als de genafwijking van het familielid bekend is.