Bij het zoeken naar de diagnose wordt er gelet op een verhoging van lactaat en alanine. Deze stof kan opgespoord worden in het bloed. Om te onderzoeken of de hersenen ook een gebrek aan energie hebben, kan er hersenvocht worden afgenomen via een ruggenprik. Er is sprake van een energietekort als men ook in het hersenvocht een verhoging van lactaat vindt. Daarnaast kan een MRI-scan van de hersenen aanwijzingen geven voor het Syndroom van Leigh, er kunnen symmetrische afwijkingen worden gevonden in de basale kernen en/of hersenstam. Vervolgens kan men met een spierbiopt achterhalen welke omzetting niet goed verloopt waardoor er een energietekort ontstaat.

Met DNA-onderzoek kan men de afwijking in het genetisch materiaal opsporen. Helaas kan nog niet bij alle patiënten het afwijkende gen gevonden worden. Dit komt doordat nog niet alle genafwijkingen bekend zijn, die tot het Syndroom van Leigh leiden.